Yutaka Nagaia,b, Toshiaki Suzukia, Susumu Yamashitaa, Toshio Johc, Yuji Tasakid,*.

aLaboratoire de développement et de recherche, Niigata Meijo Co., Ltd., 1-8-39 Toei, Ojiya, Niigata 947-0004, Japon

bÉcole supérieure de science et de technologie et cDépartement de chimie biologique appliquée, Faculté d'agriculture, Université de Niigata, 2-8050 Ikarashi, Nishi-ku, Niigata, Niigata 950-2181, Japon.

dDépartement d'ingénierie des matériaux, Institut national de technologie, Collège de Nagaoka, 888, Nishikatagai, Nagaoka, Niigata 940-8532, Japon

*Auteur correspondant :

Y. Tasaki

Tél : +81-258-34-9405

Fax : +81-258-34-9700

Courriel : ytasaki@nagaoka-ct.ac.jp

Texte : 10 pages ; tableaux : 1 ; figures : 1

Résumé

Nous décrivons ici C8-222, une nouvelle souche de Saccharomyces cerevisiae Meijo-9 résistante à la cérulénine qui code pour une mutation ponctuelle( mutationFAS2-1253A ) entraînant une substitution de Gly en Ala à la position 1 253 de la sous-unité alpha de l'acide gras synthase (protéine Fas2), qui a été isolée par criblage traditionnel en présence de cérulénine. Cette mutation a notamment entraîné une production accrue d'acide caprylique, mais pas d'acide caproïque. Comme l'acide caprylique est un précurseur du caprylate d'éthyle, un composé qui confère des arômes " fruités-fleuris ", l'utilisation de ce mutant pourrait permettre la production de nouveaux types de saké.

Mots clés: Acide gras à chaîne moyenne C8, souche résistante à la cérulénine, acide gras synthase, composant de l'arôme, levure de saké.

Saccharomyces cerevisiae est un microorganisme clé dans l'industrie des boissons alcoolisées, utilisé non seulement comme agent de fermentation, mais aussi comme déterminant de la saveur. Par conséquent, les souches de levure présentant des caractéristiques spécifiques ou souhaitables sont continuellement recherchées pour améliorer la qualité ou les processus de fabrication des boissons alcoolisées. En ce qui concerne la saveur, la souche de levure K-1801 (Yoshida 2006), qui produit des niveaux élevés de caproate d'éthyle, un composant de saveur désirable semblable à celle de la pomme, est maintenant largement utilisée pour produire du saké, une boisson alcoolisée japonaise. K-1801 a été isolée à l'origine comme un mutant qui présentait une résistance à l'antibiotique cérulénine, un inhibiteur de l'acide gras synthase, par culture en présence de cérulénine (Inokoshi et al. 1994). Les niveaux élevés de production de caproate d'éthyle observés dans cette souche sont probablement dus à une synthèse accrue du précurseur qu'est l'acide caproïque (acide hexanoïque, acide gras à chaîne moyenne en C6). Par ailleurs, on a découvert que la résistance à la cérulénine et les niveaux élevés de production d'acide caproïque présentés par la souche K-1801 résultaient d'une mutation ponctuelle dans le gène FAS2 de la synthase des acides gras, entraînant une substitution d'acide aminé (Gly1250Ser, 1250S) à la position 1 250 de la sous-unité alpha de la synthase des acides gras (protéine Fas2) (Aritomi et al. 2004).

L'acide gras synthase fongique est un complexe hétérodécamérique composé de six sous-unités α et six β (a6b6), codées respectivement par les gènes FAS2 et FAS1, qui catalyse toutes les étapes de la synthèse des acides gras. En conséquence, FAS2 est devenu une plateforme importante pour manipuler la composition en acides gras et la saveur du saké. Cependant, le mécanisme qui régit la production élevée d'acide caproïque dans le mutant K-1801 résistant à la cérulénine reste obscur. En outre, d'autres souches de levure résistantes à la cérulénine codant pour d'autres mutations de FAS2 doivent encore être isolées.

Nous décrivons ici une nouvelle mutation dans FAS2 de la souche de levure de saké Meijo-9, une levure diploïde isolée à l'origine par la Niigata Meijo Co., Ltd. (Ojiya, Niigata, Japon), qui a été générée par une approche de criblage mutationnel et confirmée comme étant S. cerevisiae par séquençage de l'ADNr 26S. En bref, 1 × 106 UFC/plaque de la souche de levure parentale a été cultivée sur un milieu SD [2 % de glucose, 0,67 % de base azotée de levure Difco sans acides aminés (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)] contenant 1 mg-L-1 de cérulénine pendant 7 jours à 30 °C. Un total de 72 colonies résistantes à la cérulénine ont ensuite été isolées, utilisées pour inoculer 10 mL de milieu YPD (1 % d'extrait de levure, 2 % de polypeptone et 2 % de glucose), et cultivées à 30 °C pendant 2 jours. Les concentrations d'acides gras libres dans le surnageant de culture de chaque souche ont été mesurées au préalable, comme décrit précédemment (Tomotake et al. 2006). La souche C8-222 présentait une expression abondante d'acides gras libres et a donc été sélectionnée pour une caractérisation plus poussée.

Le séquençage du gène FAS2 de C8-222 a révélé une nouvelle mutation ponctuelle (G vers C) au nucléotide 3 758 du cadre de lecture ouvert de FAS2 qui a entraîné une substitution Gly vers Ala au niveau du résidu 1 253 (Gly1253Ala, 1253A) de la protéine Fas2 (Fig. 1A). De plus, seul un pic spécifique à la cytosine a été détecté à la position de cette mutation, indiquant que la mutation FAS2-1253A était homozygote. La séquence d'ADN de FAS2 de Meijo-9 a été soumise à la base de données des séquences nucléotidiques de la DDBJ sous le numéro d'accession LC093835.

Pour analyser les acides gras libres et les esters d'acides gras produits par les souches parentales et mutantes C8-222, chaque souche a été cultivée dans 300 mL de milieu d'extrait de koji à 25 °C pendant 5 jours. Les concentrations d'acides gras libres dans le surnageant de culture ont été mesurées par chromatographie en phase gazeuse (CG), comme décrit précédemment (de Jong et Badings, 1990). En bref, les conditions de GC étaient les suivantes : instrument, GC-14B (Shimadzu, Kyoto, Japon) ; détection, ionisation de flamme ; colonne, InertCap FFAP de type capillaire en silice fondue (0,25 mm de diamètre interne × 15 m ; df = 0,25 mm ; GL Sciences, Tokyo, Japon) ; température de la colonne, 100 °C pendant 5 min, augmentée à 240 °C à 10 °C/min, puis maintenue pendant 20 min ; gaz porteur, hélium à 50 kPa. La composition en acides gras libres des souches parentales et des souches mutantes C8-222 est présentée à la figure 1B. Notamment, alors qu'il n'y avait aucune différence dans la quantité d'acide caproïque produite par chaque souche, la souche C8-222 a produit des niveaux nettement plus élevés d'acide caprylique (acide octanoïque, acide gras à chaîne moyenne en C8 ; 4,24 mg-L-1) que la souche parentale (0,91 mg-L-1). Parallèlement, la concentration de caprylate d'éthyle dans le surnageant de culture récolté de chaque souche a été mesurée comme décrit précédemment (Ina et al. 1990). Comme prévu, la souche C8-222 a également produit des niveaux plus élevés de caprylate d'éthyle (2,00 mg-L-1) que la souche parentale (0,92 mg-L-1). À notre connaissance, il s'agit de la première analyse d'une mutation de FAS2 qui augmente sélectivement la synthèse de l'acide caprylique, un précurseur du caprylate d'éthyle (Ichikawa et al. 1991) qui confère au saké des saveurs " fruitées-fleuries " (González et al. 2007). Ainsi, l'utilisation de C8-222 peut permettre la production de saké avec un profil d'arôme distinct.

Une approche de mutagenèse dirigée in vitro a ensuite été utilisée pour confirmer l'effet de la mutation Gly1253Ala sur la composition en acides gras libres de S. cerevisiae. En bref, le plasmide pRSFAS6, qui contient une version mutée de FAS2(FAS2-1250S; (Akada et al. 1999), a été obtenu du National Bio-Resource Project (NBRP) du Ministère de l'Education, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie (MEXT) du Japon. Plus précisément, la séquence nucléotidique de l'allèle FAS2-1250S a été précédemment modifiée de la séquence GGT (Gly) de type sauvage à une séquence AGT (Ser) au codon 1 250. Par conséquent, la mutation Gly1250Ser dans pRSFAS6 a été ramenée à la séquence de type sauvage à l'aide du kit de mutagenèse dirigée QuikChange II XL (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), générant ainsi le plasmide pFAS2-1250G-3. La nouvelle mutation Gly1253Ala a ensuite été introduite dans pFAS2-1250G-3 par mutagenèse dirigée in vitro, ce qui a donné le plasmide pFAS2-1253A-31. Ces trois plasmides ont ensuite été introduits dans la souche de laboratoire YPH250 (type sauvage) de S. cerevisiae à l'aide d'un kit de transformation directe de S. cerevisiae (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japon), et les transformants contenant chaque plasmide ont été caractérisés plus avant.

La résistance à la cérulénine a été étudiée comme décrit précédemment (Kotaka et al. 2010), mais avec quelques modifications. En bref, les souches ont été cultivées dans 5 ml de milieu YPD à 30 °C pendant 2 jours. Les cellules ont ensuite été récoltées, lavées avec de l'eau stérilisée, diluées en série 10 fois, déposées sur un milieu SD solide contenant 1 mg-L-1 de cérulénine et incubées à 25 °C pendant 4 jours. Notamment, les transformants NM-C6 et NM-C8, qui expriment les variants Gly1250Ser et Gly1253Ala de Fas2, respectivement, mais pas la souche de type sauvage (YPH250) ni le transformant NM-C, qui code pour un gène FAS2 de type sauvage, ont présenté une croissance en présence de l'antibiotique (tableau 1). Ces résultats confirment que les mutations Gly1250Ser et Gly1253Ala confèrent toutes deux une résistance à la cérulénine.

La souche YPH250 et trois transformants, NM-C, NM-C8, et NM-C6, ont été cultivés dans 300 mL de milieu d'extrait de koji à 15 °C pendant 7 jours, et les concentrations d'acides gras libres dans les surnageants de culture résultants ont été mesurées comme décrit (de Jong et Badings 1990). NM-C8 a produit 1,6 à 2,1 fois plus d'acide caprylique que YPH250, NM-C ou NM-C6 (tableau 1), ce qui suggère que la mutation Gly1253Ala entraîne une production abondante d'acide caprylique.

Dans cette étude, nous avons démontré que la souche C8-222 résistante à la cérulénine, qui code pour l'allèle FAS2-Gly1253Ala , présente une production élevée d'acide caprylique. Les résultats présentés ici indiquent que les changements structurels causés par la mutation Gly1253, ainsi que par la mutation Gly1250, affectent la longueur de la chaîne des acides gras produits par la protéine Fas2. Dans une étude précédente, (Akada et al. 1999) ont construit des souches codant pour les mutations Gly1250Ala (1250A ; FAS2-1250A) et Gly1250Cys (1250C ; FAS2-1250C) de FAS2 et ont constaté que l'augmentation du volume de la chaîne latérale du 1 250e acide aminé entraînait une production accrue d'acide caproïque. On suppose que cette production accrue est due à une plus grande inhibition de la synthèse des acides gras (c'est-à-dire de l'activité enzymatique de Fas2) par le biais de l'augmentation du volume de la chaîne latérale (Aritomi et al. 2004). Cependant, la relation entre l'activité enzymatique de Fas2 et Gly1250 et Gly1253 reste peu claire. Une analyse structurelle plus poussée de la protéine Fas2 est donc nécessaire pour élucider le mécanisme régissant la production accrue d'acides gras en C6 ou C8 chez la levure.

En résumé, nous avons isolé une souche de levure résistante à la cérulénine codant pour une nouvelle mutation de FAS2 qui stimule sélectivement la production d'acide caprylique.Nos résultats devraient faciliter l'amélioration des levures de saké.

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Divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt. Toutes les expériences entreprises dans cette étude sont conformes aux lois en vigueur au Japon.

Remerciements

Nous remercions les membres de l'Institut préfectoral de recherche sur le saké de Niigata pour leur soutien et leur aide. En particulier, nous sommes reconnaissants au directeur Ken-ichi Watanabe pour les discussions utiles et les encouragements chaleureux. Nous remercions également le NBRP du MEXT, Japon, pour avoir fourni la souche YPH250 de S. cerevisiae et le plasmide pRSFAS6.

RÉFÉRENCES

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Légendes des figures

Fig. 1. Identification d'une nouvelle mutation dans le gène FAS2 de Saccharomyces cerevisiae. A : Séquençage de l'ADN des loci FAS2 de la souche de levure de saké de type sauvage Meijo-9 et de la souche mutante C8-222. Les flèches marquent la mutation de G en C au nucléotide 3 758 du cadre de lecture ouvert de FAS2, et la substitution d'acide aminé correspondante de Gly en Ala au codon 1 253. B : Profils d'acides gras libres de Meijo-9 et C8-222.