Yutaka Nagaia,b, Toshiaki Suzukia, Susumu Yamashitaa, Toshio Johc, Yuji Tasakid,*.

aLaboratorio de Desarrollo e Investigación, Niigata Meijo Co., Ltd., 1-8-39 Toei, Ojiya, Niigata 947-0004, Japón.

bEscuela de Postgrado de Ciencia y Tecnología, y cDepartamento de Química Biológica Aplicada, Facultad de Agricultura, Universidad de Niigata, 2-8050 Ikarashi, Nishi-ku, Niigata, Niigata 950-2181, Japón.

dDepartamento de Ingeniería de Materiales, Instituto Nacional de Tecnología, Escuela Superior de Nagaoka, 888, Nishikatagai, Nagaoka, Niigata 940-8532, Japón.

*Autor corresponsal:

Y. Tasaki

Tel: +81-258-34-9405

Fax: +81-258-34-9700

Correo electrónico: ytasaki@nagaoka-ct.ac.jp

Texto: 10 páginas; tablas: 1; figuras: 1

Resumen

Aquí describimos la cepa C8-222, una nueva cepa de Saccharomyces cerevisiae Meijo-9 resistente a la cerulenina que codifica una mutación puntual( mutaciónFAS2-1253A ) que da lugar a una sustitución de Gly por Ala en la posición 1.253 de la subunidad alfa de la sintasa de ácidos grasos (proteína Fas2), que se aisló mediante cribado tradicional en presencia de cerulenina. En particular, esta mutación aumentó la producción de ácido caprílico, pero no la de ácido caproico. Dado que el ácido caprílico es un precursor del caprilato de etilo, un compuesto que confiere sabores "afrutados-florales", el uso de este mutante podría permitir la producción de nuevos tipos de sake.

Palabras clave: Ácido graso de cadena media C8, Cepa resistente a la cerulenina, Ácido graso sintasa, Componente del sabor, Levadura del sake

Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo clave en la industria de las bebidas alcohólicas que se utiliza, no sólo como agente de fermentación, sino también como determinante del sabor. De ahí que se busquen continuamente cepas de levadura con características específicas o deseables para mejorar la calidad o los procesos de fabricación de bebidas alcohólicas. En cuanto al sabor, la cepa de levadura K-1801 (Yoshida 2006), que produce altos niveles del deseable componente del sabor a manzana caproato de etilo, se utiliza ahora ampliamente para producir sake, una bebida alcohólica japonesa. K-1801 se aisló originalmente como un mutante que mostraba resistencia al antibiótico cerulenina, un inhibidor de la sintasa de ácidos grasos, mediante cultivo en presencia de cerulenina (Inokoshi et al. 1994). Los elevados niveles de producción de caproato de etilo observados en esta cepa se deben probablemente a una mayor síntesis del precursor ácido caproico (ácido hexanoico, ácido graso de cadena media C6). Mientras tanto, se descubrió que la resistencia a la cerulenina y los elevados niveles de producción de ácido caproico que presenta K-1801 son el resultado de una mutación puntual en el gen de la sintasa de ácidos grasos FAS2, que da lugar a una sustitución de aminoácidos (Gly1250Ser, 1250S) en la posición 1.250 de la subunidad alfa de la sintasa de ácidos grasos (proteína Fas2) (Aritomi et al. 2004).

La sintasa fúngica de ácidos grasos es un complejo heterododecamérico compuesto por seis subunidades α y seis β (a6b6), codificadas por los genes FAS2 y FAS1, respectivamente, que cataliza todos los pasos de la síntesis de ácidos grasos. En consecuencia, el FAS2 se ha convertido en una importante plataforma para manipular la composición de ácidos grasos y el sabor del sake. Sin embargo, el mecanismo que rige la elevada producción de ácido caproico en el mutante K-1801 resistente a la cerulenina sigue sin estar claro. Además, todavía no se han aislado otras cepas de levadura resistentes a la cerulenina que codifiquen otras mutaciones en FAS2.

Aquí describimos una nueva mutación en FAS2 de la cepa de levadura del sake Meijo-9, una levadura diploide aislada originalmente por la Niigata Meijo Co., Ltd. (Ojiya, Japón). (Ojiya, Niigata, Japón), que se generó mediante un método de cribado mutacional y se confirmó que era S. cerevisiae mediante secuenciación del ADNr 26S. Brevemente, se cultivaron 1 × 106 UFC/placa de la cepa de levadura parental en medio SD [2% de glucosa, 0,67% de base nitrogenada de levadura Difco sin aminoácidos (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) ] que contenía 1 mg-L-1 de cerulenina durante 7 días a 30 °C. Se obtuvieron un total de 72 ceruleninas de la cepa de levadura parental. A continuación, se aislaron un total de 72 colonias resistentes a la cerulenina, que se utilizaron para inocular 10 mL de medio YPD (1% de extracto de levadura, 2% de polipeptona y 2% de glucosa) y se cultivaron a 30 °C durante 2 d. Se midieron preliminarmente las concentraciones de ácidos grasos libres en el sobrenadante de cultivo de cada cepa, tal como se ha descrito anteriormente (Tomotake et al. 2006). La cepa C8-222 mostró una expresión abundante de ácidos grasos libres, por lo que se seleccionó para su caracterización posterior.

La secuenciación del gen FAS2 de C8-222 reveló una nueva mutación puntual (de G a C) en el nucleótido 3.758 del marco de lectura abierto de FAS2 que dio lugar a una sustitución de Gly por Ala en el residuo 1.253 (Gly1253Ala, 1253A) de la proteína Fas2 (Fig. 1A). Además, sólo se detectó un pico específico de citosina en la posición de esta mutación, lo que indicaba que la mutación FAS2-1253A era homocigota. La secuencia de ADN de FAS2 de Meijo-9 se ha enviado a la base de datos de secuencias de nucleótidos DDBJ con el número de acceso LC093835.

Para analizar los ácidos grasos libres y los ésteres de ácidos grasos producidos por las cepas parentales y mutantes C8-222, cada cepa se cultivó en 300 mL de medio de extracto de koji a 25 °C durante 5 d. Las concentraciones de ácidos grasos libres en el sobrenadante del cultivo se midieron mediante cromatografía de gases (GC), como se describió anteriormente (de Jong y Badings 1990). Brevemente, las condiciones de GC fueron las siguientes: instrumento, GC-14B (Shimadzu, Kyoto, Japón); detección, ionización de llama; columna, tipo capilar de sílice fundida InertCap FFAP (0,25 mm D.I. × 15 m; df = 0,25 mm; GL Sciences, Tokio, Japón); temperatura de la columna, 100 °C durante 5 min, aumentada a 240 °C a 10 °C/min, y luego mantenida durante 20 min; gas portador, helio a 50 kPa. La composición de ácidos grasos libres de las cepas parentales y mutantes C8-222 se muestra en la Fig. 1B. En particular, aunque no hubo diferencias en la cantidad de ácido caproico producida por cada cepa, C8-222 produjo niveles notablemente superiores de ácido caprílico (ácido octanoico, ácido graso de cadena media C8; 4,24 mg-L-1) que la cepa parental (0,91 mg-L-1). Mientras tanto, se midió la concentración de caprilato de etilo en el sobrenadante del cultivo cosechado de cada cepa, tal como se ha descrito anteriormente (Ina et al. 1990). Como era de esperar, C8-222 también produjo niveles más altos de caprilato de etilo (2,00 mg-L-1) que la cepa parental (0,92 mg-L-1). Hasta donde sabemos, este es el primer análisis de una mutación de FAS2 que aumenta selectivamente la síntesis de ácido caprílico, un precursor del caprilato de etilo (Ichikawa et al. 1991) que confiere sabores "afrutados-florales" al sake (González et al. 2007). Así pues, el uso de C8-222 puede permitir la producción de sake con un perfil de sabor distinto.

A continuación, se utilizó un método de mutagénesis in vitro para confirmar el efecto de la mutación Gly1253Ala en la composición de ácidos grasos libres de S. cerevisiae. Brevemente, el plásmido PRSFAS6, que contiene una versión mutada de FAS2(FAS2-1250S; (Akada et al. 1999), se obtuvo del Proyecto Nacional de Bio-Recursos (NBRP) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón. Específicamente, la secuencia de nucleótidos del alelo FAS2-1250S fue previamente alterada de la secuencia GGT (Gly) de tipo salvaje a una AGT (Ser) en el codón 1.250. Por lo tanto, la mutación Gly1250Ser en pRSFAS6 se revirtió a la secuencia de tipo silvestre utilizando un kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II XL (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.), generando así el plásmido pFAS2-1250G-3. A continuación, se introdujo la nueva mutación Gly1253Ala en pFAS2-1250G-3 mediante mutagénesis in vitro dirigida al sitio, generándose el plásmido pFAS2-1253A-31. A continuación, estos tres plásmidos se introdujeron en la cepa YPH250 de S. cerevisiae de laboratorio (de tipo salvaje) utilizando un kit de transformación directa de S. cerevisiae (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japón), y se caracterizaron las transformantes que contenían cada plásmido.

La resistencia a la cerulenina se investigó como se describió anteriormente (Kotaka et al. 2010), pero con algunas modificaciones. Brevemente, las cepas se cultivaron en 5 mL de medio YPD a 30 °C durante 2 d. A continuación, se cosecharon las células, se lavaron con agua esterilizada, se diluyeron 10 veces en serie, se mancharon en medio SD sólido que contenía 1 mg-L-1 de cerulenina, y se incubaron a 25 °C durante 4 días. En particular, tanto los transformantes NM-C6 como NM-C8, que expresaban las variantes Fas2 Gly1250Ser y Gly1253Ala, respectivamente, pero no la cepa de tipo salvaje (YPH250) ni el transformante NM-C, que codificaba un gen FAS2 de tipo salvaje, mostraron crecimiento en presencia del antibiótico (Tabla 1). Estos resultados confirman que las mutaciones Gly1250Ser y Gly1253Ala confieren resistencia a la cerulenina.

La cepa YPH250 y tres transformantes, NM-C, NM-C8 y NM-C6, se cultivaron en 300 mL de medio de extracto de koji a 15 °C durante 7 días, y las concentraciones de ácidos grasos libres en los sobrenadantes de cultivo resultantes se midieron como se describe (de Jong y Badings 1990). NM-C8 produjo 1,6-2,1 veces más ácido caprílico que YPH250, NM-C o NM-C6 (Tabla 1), lo que sugiere que la mutación Gly1253Ala impulsa la producción abundante de ácido caprílico.

En este estudio, demostramos que la cepa C8-222 resistente a la cerulenina, que codifica el alelo FAS2-Gly1253Ala , presenta una elevada producción de ácido caprílico. Los hallazgos aquí presentados indican que los cambios estructurales causados por la mutación Gly1253, así como por la mutación Gly1250, afectan a la longitud de cadena de los ácidos grasos producidos por la proteína Fas2. En un estudio anterior, (Akada et al. 1999) construyeron cepas que codificaban las mutaciones Gly1250Ala (1250A; FAS2-1250A) y Gly1250Cys (1250C; FAS2-1250C) en FAS2 y descubrieron que el aumento de la longitud de la cadena lateral del aminoácido 1.250 daba lugar a una mayor producción de ácido caproico. Se supone que este aumento de la producción se debe a una mayor inhibición de la síntesis de ácidos grasos (es decir, de la actividad de la enzima Fas2) a través del mayor volumen de la cadena lateral (Aritomi et al. 2004). Sin embargo, la relación entre la actividad enzimática de Fas2 y Gly1250 y Gly1253 sigue sin estar clara. Por lo tanto, se necesitan más análisis estructurales de la proteína Fas2 para dilucidar el mecanismo que rige el aumento de la producción de ácidos grasos C6 o C8 en la levadura.

En resumen, hemos aislado una cepa de levadura resistente a la cerulenina que codifica una nueva mutación de FAS2 que estimula selectivamente la producción de ácido caprílico.

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Divulgación

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Todos los experimentos realizados en este estudio cumplen la legislación vigente en Japón.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del Instituto de Investigación del Sake de la Prefectura de Niigata su apoyo y ayuda. En particular, agradecemos al Director Ken-ichi Watanabe sus útiles discusiones y su cálido aliento. También damos las gracias al NBRP del MEXT, Japón, por proporcionarnos la cepa YPH250 de S. cerevisiae y el plásmido pRSFAS6.

REFERENCIAS

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Aritomi K, Hirosawa I, Hoshida H, Shiigi M, Nishizawa Y, Kashiwagi S, Akada R, 2004. Las cepas de levadura de autoclonación que contienen nuevas mutaciones de FAS2 producen una mayor cantidad de caproato de etilo en el sake japonés. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 68: 206-214; http://dx.doi.org/10.1271/bbb.68.206.

de Jong C, Badings HT, 1990. Determination of free fatty acids in milk and cheese procedures for extraction, clean up, and capillary gas chromatographic analysis. Journal of High Resolution Chromatography 13: 94-98; http://dx.doi.org/10.1002/jhrc.1240130204.

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Leyendas de las figuras

Fig. 1. Identificación de una nueva mutación en el gen FAS2 de Saccharomyces cerevisiae. A: Secuenciación del ADN de los loci FAS2 de la cepa de levadura del sake de tipo salvaje Meijo-9 y de la cepa mutante C8-222. Las flechas marcan la mutación de G a C en el nucleótido 3.758 del marco de lectura abierta de FAS2, y la correspondiente sustitución de aminoácido de Gly a Ala en el codón 1.253. B: Perfiles de ácidos grasos libres de Meijo-9 y C8-222.