Yutaka Nagaia,b, Toshiaki Suzukia, Susumu Yamashitaa, Toshio Johc, Yuji Tasakid,*

aDevelopment and Research Laboratory, Niigata Meijo Co., Ltd., 1-8-39 Toei, Ojiya, Niigata 947-0004, Japão

bGraduação da Escola de Ciência e Tecnologia, e cDepartamento de Química Biológica Aplicada, Faculdade de Agricultura, Universidade de Niigata, 2-8050 Ikarashi, Nishi-ku, Niigata, Niigata 950-2181, Japão

dDepartamento de Engenharia de Materiais, Instituto Nacional de Tecnologia, Colégio Nagaoka, 888, Nishikatagai, Nagaoka, Niigata 940-8532, Japão

*Autor correspondente:

Y. Tasaki

Tel: +81-258-34-9405

Fax: +81-258-34-9700

E-mail: ytasaki@nagaoka-ct.ac.jp

Texto: 10 páginas; tabelas: 1; figuras: 1

Abstrato

Aqui, descrevemos a C8-222, uma nova estirpe de Saccharomyces cerevisiae Meijo-9 resistente à cerulenina que codifica uma mutação pontual( mutaçãoFAS2-1253A ) resultando numa substituição de Gly por Ala na posição 1.253 da subunidade de ácido gordo sintase alfa (proteína Fas2), que foi isolada pela triagem tradicional na presença de cerulenina. Notavelmente, esta mutação resultou numa maior produção de ácido caprílico, mas não de ácido capróico. Como o ácido caprílico é um precursor do etil caprilato, um composto que confere sabores "frutados e florais", a utilização deste mutante pode permitir a produção de novos tipos de saquê.

Palavras-chave: C8 ácido gordo de cadeia média, estirpe resistente à cerulenina, Ácido gordo sintase, Componente de sabor, Levedura de bagaço

Saccharomyces cerevisiae é um microorganismo chave na indústria das bebidas alcoólicas que é utilizado, não só como agente de fermentação, mas também como determinante do sabor. Assim, são continuamente procuradas estirpes de levedura com características específicas ou desejáveis para melhorar a qualidade ou processos de fabrico de bebidas alcoólicas. Em relação ao sabor, a estirpe de levedura K-1801 (Yoshida 2006), que produz níveis elevados do desejável caproato de etilo componente de sabor de maçã, é agora amplamente utilizada para produzir saquê, uma bebida alcoólica japonesa. O K-1801 foi originalmente isolado como mutante que exibia resistência ao antibiótico cerulenina, um inibidor de ácido gordo sintase, através do cultivo na presença de cerulenina (Inokoshi et al. 1994). Os níveis elevados de produção de caproato de etilo observados nesta estirpe são provavelmente devidos ao aumento da síntese do ácido capróico precursor (ácido hexanóico, ácido gordo de cadeia média C6). Entretanto, a resistência à cerulenina e os níveis elevados de produção de ácido caproico exibidos por K-1801 foram encontrados como resultado de uma mutação pontual no gene de ácido gordo sintase FAS2, resultando numa substituição de aminoácidos (Gly1250Ser, 1250S) na posição 1,250 da subunidade alfa de ácido gordo sintase (proteína Fas2) (Aritomi et al. 2004).

A sintetase do ácido gordo fúngico é um complexo heterododecano composto por seis subunidades α e seis β (a6b6), que são codificadas pelos genes FAS2 e FAS1, respectivamente, que catalisam todas as etapas da síntese do ácido gordo. Assim, o FAS2 tornou-se uma plataforma importante para a manipulação da composição e sabor do ácido gordo. Contudo, o mecanismo que rege a elevada produção de ácido capróico no mutante K-1801 resistente à cerulenina permanece pouco claro. Além disso, as estirpes adicionais de levedura resistente à cerulenina que codificam outras mutações em FAS2 têm ainda de ser isoladas.

Aqui, descrevemos uma nova mutação em FAS2 da estirpe de levedura de saquê Meijo-9, uma levedura diplóide originalmente isolada pela Niigata Meijo Co., Ltd. (Ojiya, Niigata, Japão), que foi gerada através de uma abordagem de rastreio mutacional e confirmada como sendo S. cerevisiae por 26S rDNA sequenciação. Em resumo, 1 × 106 UFC/placa da estirpe de levedura parental foi cultivada em meio SD [2% de glucose, 0,67% de base de azoto Difco sem aminoácidos (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, EUA) ] contendo 1 mg-L-1 de cerulenina para 7 d a 30 °C. Um total de 72 colónias resistentes à cerulenina foram então isoladas, utilizadas para inocular 10 mL de meio YPD (1% de extracto de levedura, 2% de polipetona, e 2% de glucose), e cultivadas a 30 °C para 2 d. As concentrações de ácidos gordos livres no sobrenadante da cultura de cada estirpe foram medidas preliminarmente, como descrito anteriormente (Tomotake et al. 2006). A estirpe C8-222 exibiu uma expressão abundante de ácidos gordos livres e foi, portanto, seleccionada para posterior caracterização.

A sequência do gene FAS2 de C8-222 revelou uma nova mutação pontual (G a C) no nucleótido 3.758 do quadro de leitura aberta FAS2 que resultou numa substituição de Gly por Ala no resíduo 1.253 (Gly1253Ala, 1253A) da proteína Fas2 (Fig. 1A). Além disso, apenas um pico específico de citosina foi detectado na posição desta mutação, indicando que a mutação FAS2-1253A era homozigotos. A sequência de ADN da FAS2 de Meijo-9 foi submetida à base de dados da sequência de nucleótidos DDBJ sob o número de adesão LC093835.

Para analisar os ácidos gordos livres e os ésteres de ácidos gordos produzidos pelas estirpes parentais e mutantes C8-222, cada estirpe foi cultivada em 300 mL de meio de extracção de koji a 25 °C durante 5 d. As concentrações de ácidos gordos livres no sobrenadante da cultura foram medidas por cromatografia gasosa (GC), como descrito anteriormente (de Jong e Badings 1990). Resumidamente, as condições de GC foram as seguintes: instrumento, GC-14B (Shimadzu, Kyoto, Japão); detecção, ionização de chama; coluna, InertCap FFAP tipo capilar de sílica fundida (0,25 mm I.D. × 15 m; df = 0,25 mm; GL Sciences, Tóquio, Japão); temperatura da coluna, 100 °C durante 5 min, aumentada para 240 °C a 10 °C/min, e depois mantida durante 20 min; gás portador, hélio a 50 kPa. A composição em ácido gordo livre das estirpes parentais e C8-222 mutantes é mostrada na Fig. 1B. Notavelmente, enquanto não houve diferença na quantidade de ácido capróico produzido por cada estirpe, o C8-222 produziu níveis marcadamente mais elevados de ácido caprílico (ácido octanóico, ácido gordo de cadeia média C8; 4,24 mg-L-1) do que a estirpe parental (0,91 mg-L-1). Entretanto, a concentração de caprilato etílico no sobrenadante de cultura colhido de cada estirpe foi medida conforme descrito anteriormente (Ina et al. 1990). Como esperado, o C8-222 também produziu níveis mais elevados de níveis de caprilato de etilo (2,00 mg-L-1) do que a estirpe parental (0,92 mg-L-1). Tanto quanto sabemos, esta é a primeira análise de uma mutação FAS2 que aumenta selectivamente a síntese de ácido caprílico, um precursor do caprilato de etilo (Ichikawa et al. 1991) que confere sabores "frutados e florais" (González et al. 2007). Assim, a utilização do C8-222 pode permitir a produção de saquê com um perfil de sabor distinto.

Foi então utilizada uma abordagem in vitro de mutagénese dirigida ao local para confirmar o efeito da mutação Gly1253Ala na composição de ácidos gordos livres de S. cerevisiae. Brevemente, o plasmídeo pRSFAS6, que contém uma versão mutante de FAS2(FAS2-1250S; (Akada et al. 1999), foi obtido do Projecto Nacional de Recursos Biológicos (NBRP) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia (MEXT) do Japão. Especificamente, a sequência nucleotídica do alelo FAS2-1250S foi previamente alterada da sequência de tipo selvagem GGT (Gly) para um AGT (Ser) no códão 1,250. Portanto, a mutação Gly1250Ser em pRSFAS6 foi revertida para a sequência de tipo selvagem usando um QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), gerando assim o plasmídeo pFAS2-1250G-3. A nova mutação Gly1253Ala foi então introduzida no pFAS2-1250G-3 por mutagénese in vitro dirigida ao local, produzindo plasmídeo pFAS2-1253A-31. Estes três plasmídeos foram então entregues no laboratório da estirpe S. cerevisiae YPH250 (tipo selvagem) usando um Kit de Transformação Directa de S. cerevisiae (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japão), e os transformantes contendo cada plasmídeo foram ainda mais caracterizados.

A Cerulenin resistance foi investigada como descrito anteriormente (Kotaka et al. 2010), mas com algumas modificações. Em resumo, as estirpes foram cultivadas em 5 mL de meio YPD a 30 °C durante 2 d. As células foram então colhidas, lavadas com água esterilizada, diluídas em série 10 vezes, manchadas em meio sólido SD contendo 1 mg-L-1 de cerulenina, e incubadas a 25 °C durante 4 d. Notavelmente, ambos os transformantes NM-C6 e NM-C8, que exprimiram as variantes Fas2 Gly1250Ser e Gly1253Ala, respectivamente, mas não a estirpe do tipo selvagem (YPH250) ou o transformante NM-C, que codificou um gene FAS2 do tipo selvagem, apresentaram crescimento na presença do antibiótico (Quadro 1). Estes resultados confirmam que tanto a mutação Gly1250Ser como a mutação Gly1253Ala conferem resistência à cerulenina.

A deformação YPH250 e três transformantes, NM-C, NM-C8, e NM-C6, foram cultivados em 300 mL de meio de extracção de koji a 15 °C para 7 d, e as concentrações de ácidos gordos livres nos sobrenadantes resultantes da cultura foram medidas conforme descrito (de Jong e Badings 1990). O NM-C8 produziu 1,6-2,1 vezes mais ácido caprílico do que o YPH250, NM-C, ou NM-C6 (Quadro 1), sugerindo que a mutação Gly1253Ala impulsiona a produção abundante de ácido caprílico.

Neste estudo, demonstrámos que a estirpe C8-222, resistente à cerulenina, que codifica o alelo FAS2-Gly1253Ala , apresenta uma elevada produção de ácido caprílico. Os resultados aqui apresentados indicam que as alterações estruturais causadas pela mutação Gly1253, bem como pela mutação Gly1250, afectam o comprimento da cadeia dos ácidos gordos produzidos pela proteína Fas2. Num estudo anterior, (Akada et al. 1999) construíram as mutações Gly1250Ala (1250A; FAS2-1250A) e Gly1250Cys (1250C; FAS2-1250C) na FAS2 e descobriram que o aumento da maior parte da cadeia lateral do 1.250º aminoácido resultou no aumento da produção de ácido capróico. Presume-se que este aumento da produção se deva a uma maior inibição da síntese de ácidos gordos (ou seja, actividade enzimática Fas2) através do aumento da maior parte da cadeia lateral (Aritomi et al. 2004). No entanto, a relação entre a actividade enzimática Fas2 e as enzimas Gly1250 e Gly1253 permanece pouco clara. Por conseguinte, é necessária uma análise estrutural mais aprofundada da proteína Fas2 para elucidar o mecanismo que rege o aumento da produção de ácidos gordos C6 ou C8 em leveduras.

Em resumo, isolámos uma estirpe de levedura resistente à cerulenina que codifica uma nova mutação FAS2 que estimula selectivamente a produção de ácido caprílico.

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Divulgação

Os autores declaram não haver conflito de interesses. Todas as experiências realizadas neste estudo estão em conformidade com as leis actuais do Japão.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros do Niigata Prefectural Sake Research Institute pelo seu apoio e ajuda. Em particular, agradecemos ao Director Ken-ichi Watanabe pelas discussões úteis e pelo caloroso encorajamento. Agradecemos também ao NBRP do MEXT, Japão, por fornecer a estirpe YPH250 de S. cerevisiae e o plasmídeo pRSFAS6.

REFERÊNCIAS

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Legendas das figuras

Fig. 1. Identificação de uma nova mutação no gene FAS2 de Saccharomyces cerevisiae. A: Sequenciação do ADN dos loci FAS2 da estirpe Meijo-9 de levedura do tipo selvagem e da estirpe mutante C8-222. As setas marcam a mutação G a C no nucleótido 3,758 do quadro de leitura aberto FAS2, e a correspondente substituição de Gly por Ala aminoácido no códão 1,253. B: Perfis de ácidos gordos livres de Meijo-9 e C8-222.