Yutaka Nagaia,b, Toshiaki Suzukia, Susumu Yamashitaa, Toshio Johc, Yuji Tasakid,*

aEntwicklungs- und Forschungslabor, Niigata Meijo Co., Ltd, 1-8-39 Toei, Ojiya, Niigata 947-0004, Japan

bGraduate School of Science and Technology, und cAbteilung für angewandte biologische Chemie, Fakultät für Landwirtschaft, Universität Niigata, 2-8050 Ikarashi, Nishi-ku, Niigata, Niigata 950-2181, Japan

dAbteilung für Werkstofftechnik, Nationales Institut für Technologie, Nagaoka College, 888, Nishikatagai, Nagaoka, Niigata 940-8532, Japan

*Berichterstattender Autor:

Y. Tasaki

Tel: +81-258-34-9405

Fax: +81-258-34-9700

E-Mail: ytasaki@nagaoka-ct.ac.jp

Text: 10 Seiten; Tabellen: 1; Abbildungen: 1

Abstrakt

Wir beschreiben hier C8-222, einen neuen Cerulenin-resistenten Stamm von Saccharomyces cerevisiae Meijo-9, der für eine Punktmutation(FAS2-1253A-Mutation ) kodiert, die zu einer Gly-zu-Ala-Substitution an Position 1.253 der Fettsäure-Synthase-Alpha-Untereinheit (Fas2-Protein) führt und durch traditionelles Screening in Gegenwart von Cerulenin isoliert wurde. Diese Mutation führte zu einer erhöhten Produktion von Caprylsäure, aber nicht von Capronsäure. Da Caprylsäure ein Vorläufer von Ethylcaprylat ist, einer Verbindung, die einen "fruchtig-blumigen" Geschmack verleiht, könnte die Verwendung dieser Mutante die Herstellung neuer Arten von Sake ermöglichen.

Schlüsselwörter: Mittelkettige C8-Fettsäure, Cerulenin-resistenter Stamm, Fettsäure-Synthase, Geschmackskomponente, Sake-Hefe

Saccharomyces cerevisiae ist ein wichtiger Mikroorganismus in der alkoholischen Getränkeindustrie, der nicht nur als Gärungsmittel, sondern auch als geschmacksbestimmender Faktor eingesetzt wird. Daher wird ständig nach Hefestämmen mit spezifischen oder erwünschten Eigenschaften gesucht, um die Qualität oder die Herstellungsverfahren alkoholischer Getränke zu verbessern. Was den Geschmack betrifft, so wird der Hefestamm K-1801 (Yoshida 2006), der einen hohen Gehalt an der erwünschten apfelähnlichen Geschmackskomponente Ethylcaproat produziert, heute häufig zur Herstellung von Sake, einem japanischen alkoholischen Getränk, verwendet. K-1801 wurde ursprünglich als Mutante isoliert, die durch Kultivierung in Gegenwart von Cerulenin (Inokoshi et al. 1994) eine Resistenz gegen das Antibiotikum Cerulenin, einen Inhibitor der Fettsäuresynthase, aufwies. Die bei diesem Stamm beobachtete erhöhte Produktion von Ethylcaproat ist wahrscheinlich auf eine verstärkte Synthese des Vorläufers Caproinsäure (Hexansäure, mittelkettige C6-Fettsäure) zurückzuführen. In der Zwischenzeit wurde festgestellt, dass die Cerulenin-Resistenz und die erhöhte Produktion von Capronsäure bei K-1801 auf eine Punktmutation im Fettsäure-Synthase-Gen FAS2 zurückzuführen ist, die zu einer Aminosäuresubstitution (Gly1250Ser, 1250S) an Position 1.250 der Fettsäure-Synthase-Alpha-Untereinheit (Fas2-Protein) führt (Aritomi et al. 2004).

Die Fettsäuresynthase von Pilzen ist ein heterododekamerer Komplex, der aus sechs α- und sechs β-Untereinheiten (a6b6) besteht, die von den Genen FAS2 bzw. FAS1 kodiert werden, und der alle Schritte der Fettsäuresynthese katalysiert. Dementsprechend ist FAS2 zu einer wichtigen Plattform für die Manipulation der Fettsäurezusammensetzung und des Geschmacks von Sake geworden. Der Mechanismus, der die erhöhte Produktion von Capronsäure in der Cerulenin-resistenten K-1801-Mutante steuert, bleibt jedoch unklar. Außerdem müssen noch weitere ceruleninresistente Hefestämme isoliert werden, die für andere Mutationen in FAS2 kodieren.

Hier beschreiben wir eine neue Mutation in FAS2 des Sake-Hefestamms Meijo-9, einer diploiden Hefe, die ursprünglich von der Niigata Meijo Co., Ltd. (Ojiya, Niigata, Japan) isoliert wurde. Sie wurde durch ein Mutationsscreening generiert und durch Sequenzierung der 26S rDNA als S. cerevisiae bestätigt. Kurz gesagt wurden 1 × 106 KBE/Platte des elterlichen Hefestamms auf SD-Medium [2 % Glukose, 0,67 % Difco Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)] mit 1 mg-L-1 Cerulenin 7 Tage lang bei 30 °C kultiviert. Anschließend wurden insgesamt 72 Cerulenin-resistente Kolonien isoliert, mit 10 ml YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % Polypepton und 2 % Glukose) beimpft und 2 Tage lang bei 30 °C kultiviert. Die Konzentrationen freier Fettsäuren im Kulturüberstand der einzelnen Stämme wurden vorab gemessen, wie zuvor beschrieben (Tomotake et al. 2006). Der Stamm C8-222 wies eine hohe Konzentration an freien Fettsäuren auf und wurde daher für die weitere Charakterisierung ausgewählt.

Die Sequenzierung des FAS2-Gens von C8-222 ergab eine neue Punktmutation (G zu C) am Nukleotid 3.758 des offenen Leserasters von FAS2, die zu einer Gly-zu-Ala-Substitution am Rest 1.253 (Gly1253Ala, 1253A) des Fas2-Proteins führte (Abb. 1A). Außerdem wurde an der Position dieser Mutation nur ein Cytosin-spezifischer Peak festgestellt, was darauf hindeutet, dass die FAS2-1253A-Mutation homozygot war. Die DNA-Sequenz von FAS2 aus Meijo-9 wurde in der DDBJ-Nukleotidsequenzdatenbank unter der Zugangsnummer LC093835 hinterlegt.

Zur Analyse der freien Fettsäuren und Fettsäureester, die von den Eltern- und C8-222-Mutantenstämmen produziert wurden, wurde jeder Stamm in 300 ml Koji-Extraktmedium bei 25 °C 5 Tage lang kultiviert. Die Konzentrationen der freien Fettsäuren im Kulturüberstand wurden mittels Gaschromatographie (GC) gemessen, wie zuvor beschrieben (de Jong und Badings 1990). Kurz gesagt, die GC-Bedingungen waren wie folgt: Instrument, GC-14B (Shimadzu, Kyoto, Japan); Detektion, Flammenionisation; Säule, InertCap FFAP Fused-Silica-Kapillare (0,25 mm I.D. × 15 m; df = 0,25 mm; GL Sciences, Tokio, Japan); Säulentemperatur, 100 °C für 5 min, erhöht auf 240 °C bei 10 °C/min, und dann für 20 min gehalten; Trägergas, Helium bei 50 kPa. Die Zusammensetzung der freien Fettsäuren der elterlichen und der C8-222-Mutantenstämme ist in Abb. 1B dargestellt. Während es keinen Unterschied in der Menge der von den einzelnen Stämmen produzierten Capronsäure gab, produzierte C8-222 deutlich höhere Mengen an Caprylsäure (Octansäure, mittelkettige C8-Fettsäure; 4,24 mg-L-1) als der Elternstamm (0,91 mg-L-1). In der Zwischenzeit wurde die Konzentration von Ethylcaprylat im Kulturüberstand der einzelnen Stämme wie zuvor beschrieben gemessen (Ina et al. 1990). Wie erwartet, produzierte C8-222 ebenfalls höhere Ethylcaprylat-Konzentrationen (2,00 mg-L-1) als der Elternstamm (0,92 mg-L-1). Soweit wir wissen, ist dies die erste Analyse einer FAS2-Mutation, die selektiv die Synthese von Caprylsäure erhöht, einer Vorstufe von Ethylcaprylat (Ichikawa et al. 1991), die dem Sake einen "fruchtig-blumigen" Geschmack verleiht (González et al. 2007). Somit könnte die Verwendung von C8-222 die Herstellung von Sake mit einem besonderen Geschmacksprofil ermöglichen.

Anschließend wurde ein In-vitro-Mutageneseverfahren angewandt, um die Auswirkungen der Gly1253Ala-Mutation auf die Zusammensetzung der freien Fettsäuren in S. cerevisiae zu bestätigen. Das Plasmid pRSFAS6, das eine mutierte Version von FAS2(FAS2-1250S; (Akada et al. 1999) enthält, wurde vom National Bio-Resource Project (NBRP) des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) bezogen. Die Nukleotidsequenz des FAS2-1250S-Allels wurde zuvor von der Wildtyp-GGT-Sequenz (Gly) zu einer AGT-Sequenz (Ser) bei Codon 1.250 geändert. Daher wurde die Gly1250Ser-Mutation in pRSFAS6 mit einem QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) in die Wildtyp-Sequenz zurückverwandelt, wodurch das Plasmid pFAS2-1250G-3 entstand. Die neue Gly1253Ala-Mutation wurde dann durch in vitro ortsgerichtete Mutagenese in pFAS2-1250G-3 eingeführt, wodurch das Plasmid pFAS2-1253A-31 entstand. Diese drei Plasmide wurden dann mit einem S . cerevisiae Direct Transformation Kit (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) in den S. cerevisiae-Stamm YPH250 (Wildtyp) eingebracht, und die jedes Plasmid enthaltenden Transformanten wurden weiter charakterisiert.

Die Cerulenin-Resistenz wurde wie zuvor beschrieben untersucht (Kotaka et al. 2010), jedoch mit einigen Änderungen. Die Stämme wurden 2 Tage lang in 5 ml YPD-Medium bei 30 °C kultiviert. Anschließend wurden die Zellen geerntet, mit sterilisiertem Wasser gewaschen, 10-fach seriell verdünnt, auf ein festes SD-Medium mit 1 mg-L-1 Cerulenin getupft und 4 Tage lang bei 25 °C inkubiert. Bemerkenswert ist, dass sowohl die NM-C6- als auch die NM-C8-Transformanten, die die Fas2-Varianten Gly1250Ser bzw. Gly1253Ala exprimierten, aber nicht der Wildtyp-Stamm (YPH250) oder die NM-C-Transformante, die für ein Wildtyp-FAS2-Gen kodierte, in Gegenwart des Antibiotikums wuchsen (Tabelle 1). Diese Ergebnisse bestätigen, dass sowohl die Gly1250Ser- als auch die Gly1253Ala-Mutation eine Cerulenin-Resistenz verleihen.

Der Stamm YPH250 und die drei Transformanten NM-C, NM-C8 und NM-C6 wurden in 300 ml Koji-Extraktmedium bei 15 °C 7 Tage lang kultiviert, und die Konzentrationen freier Fettsäuren in den resultierenden Kulturüberständen wurden wie beschrieben gemessen (de Jong und Badings 1990). NM-C8 produzierte 1,6- bis 2,1-mal mehr Caprylsäure als YPH250, NM-C oder NM-C6 (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass die Mutation Gly1253Ala die reichliche Produktion von Caprylsäure fördert.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass der Cerulenin-resistente Stamm C8-222, der für das FAS2-Gly1253Ala-Allel kodiert, eine erhöhte Caprylsäureproduktion aufweist. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die strukturellen Veränderungen, die durch die Gly1253-Mutation wie auch durch die Gly1250-Mutation verursacht werden, die Kettenlänge der vom Fas2-Protein produzierten Fettsäuren beeinflussen. In einer früheren Studie (Akada et al. 1999) wurden Stämme konstruiert, die für die Mutationen Gly1250Ala (1250A; FAS2-1250A) und Gly1250Cys (1250C; FAS2-1250C) in FAS2 kodieren, und es wurde festgestellt, dass eine Vergrößerung der Seitenkette der 1.250sten Aminosäure zu einer erhöhten Produktion von Capronsäure führt. Aminosäure zu einer erhöhten Produktion von Capronsäure führte. Es wird angenommen, dass diese erhöhte Produktion auf eine stärkere Hemmung der Fettsäuresynthese (d. h. der Fas2-Enzymaktivität) durch die größere Länge der Seitenkette zurückzuführen ist (Aritomi et al. 2004). Die Beziehung zwischen der Fas2-Enzymaktivität und Gly1250 und Gly1253 bleibt jedoch unklar. Eine weitere Strukturanalyse des Fas2-Proteins ist daher erforderlich, um den Mechanismus der erhöhten Produktion von C6- oder C8-Fettsäuren in der Hefe zu klären.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir einen Cerulenin-resistenten Hefestamm isoliert haben, der für eine neuartige FAS2-Mutation kodiert, die selektiv die Produktion von Caprylsäure stimuliert, was die weitere Verbesserung von Sake-Hefen erleichtern dürfte.

advertisement

Offenlegung

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen. Alle in dieser Studie durchgeführten Experimente entsprechen den geltenden japanischen Gesetzen.

Danksagungen

Wir danken den Mitgliedern des Niigata Prefectural Sake Research Institute für ihre Unterstützung und Hilfe. Insbesondere danken wir dem Direktor Ken-ichi Watanabe für die nützlichen Diskussionen und die herzliche Ermutigung. Wir danken auch dem NBRP des MEXT, Japan, für die Bereitstellung des S. cerevisiae Stammes YPH250 und des Plasmids pRSFAS6.

REFERENZEN

Akada R, Matsuo K, Aritomi K, Nishizawa Y, 1999. Konstruktion von rekombinanter Sake-Hefe, die eine dominante FAS2-Mutation ohne fremde Sequenzen enthält, durch ein zweistufiges Genaustauschprotokoll. Journal of Bioscience and Bioengineering 87: 43-48; http://dx.doi.org/10.1016/S1389-1723(99)80006-1.

Aritomi K, Hirosawa I, Hoshida H, Shiigi M, Nishizawa Y, Kashiwagi S, Akada R, 2004. Selbstklonierende Hefestämme, die neue FAS2-Mutationen enthalten, produzieren eine höhere Menge an Ethylcaproat in japanischem Sake. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 68: 206-214; http://dx.doi.org/10.1271/bbb.68.206.

de Jong C, Badings HT, 1990. Bestimmung von freien Fettsäuren in Milch und Käse, Verfahren zur Extraktion, Reinigung und kapillargaschromatographischen Analyse. Journal of High Resolution Chromatography 13: 94-98; http://dx.doi.org/10.1002/jhrc.1240130204.

González SS, Gallo L, Climent MD, Barrio E, Querol A, 2007. Enologische Charakterisierung von natürlichen Hybriden aus Saccharomyces cerevisiae und S. kudriavzevii. Internationale Zeitschrift für Lebensmittelmikrobiologie 116: 11-18; http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2006.10.047.

Ichikawa E, Hosokawa N, Hata Y, Abe Y, Suginami K, Imayasu S, 1991. Züchtung einer Sake-Hefe mit verbesserter Ethylcaproat-Produktivität. Landwirtschaftliche und biologische Chemie 55: 2153-2154; http://dx.doi.org/10.1080/00021369.1991.10870932.

Ina K, Takasawa R, Yagi A, Ina H, Kishima I, 1990. Isothiocyanate in den Stängeln und Blättern von Wasabi(Wasabia japonica Matsum). Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi 37: 256-260; http://dx.doi.org/10.3136/nskkk1962.37.4_256.

Inokoshi J, Tomoda H, Hashimoto H, Watanabe A, Takeshima H, Ōmura S, 1994. Cerulenin-resistente Mutanten von Saccharomyces cerevisiae mit einem veränderten Fettsäure-Synthase-Gen. Molecular and General Genetics 244: 90-96; http://dx.doi.org/10.1007/bf00280191.

Kotaka A, Sahara H, Hata Y, 2010. Die Konstruktion und Anwendung von diploider Sake-Hefe mit einer homozygoten Mutation im FAS2-Gen. Journal of Bioscience and Bioengineering 110: 675-678; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiosc.2010.07.007.

Tomotake H, Okuyama R, Katagiri M, Fuzita M, Yamato M, Ota F, 2006. Vergleich zwischen Holstein-Kuhmilch und japanischer Ziegenmilch in Bezug auf Fettsäurezusammensetzung, Lipidverdaulichkeit und Proteinprofil. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 70: 2771-2774; http://dx.doi.org/10.1271/bbb.60267.

Yoshida K, 2006. Kyoukai Sake Hefe 1801. Journal of the Brewing Society of Japan 101: 910-922; http://dx.doi.org/10.6013/jbrewsocjapan1988.101.910.

Abbildung Legenden

Abb. 1. Identifizierung einer neuen Mutation im FAS2-Gen von Saccharomyces cerevisiae. A: DNA-Sequenzierung der FAS2-Loci des Wildtyp-Sake-Hefestamms Meijo-9 und des mutierten Stamms C8-222. Die Pfeile markieren die G-zu-C-Mutation am Nukleotid 3.758 des offenen Leserasters von FAS2 und die entsprechende Gly-zu-Ala-Aminosäuresubstitution am Codon 1.253. B: Profile der freien Fettsäuren von Meijo-9 und C8-222.