Yutaka Nagaia,b, Toshiaki Suzukia, Susumu Yamashitaa, Toshio Johc, Yuji Tasakid, *

a开发和研究实验室，新泻美卓有限公司，1-8-39 Toei, Ojiya, Niigata 947-0004, 日本。

b新泻大学科学技术研究生院，c新泻大学农学院应用生物化学系，地址：2-8050 Ikarashi, Nishi-ku, Niigata, Niigata 950-2181, 日本

d材料工程系，国立技术学院，长冈学院，888，Nagaoka，Nagoka，Niigata 940-8532，日本

*对应的作者。

Y. Tasaki

电话：+81-258-34-9405

传真：+81-258-34-9700

电子邮件：ytasaki@nagaoka-ct.ac.jp

文本。10页；表：1；图。1

摘要

在此，我们描述了C8-222，一种新型的抗环烯烃的Saccharomyces cerevisiaeMeijo-9菌株，它编码一个点突变（FAS2-1253A突变），导致脂肪酸合成酶α亚基（Fas2蛋白）的1,253位Gly到Ala的替换，在环烯烃存在下通过传统筛选分离出来。值得注意的是，这种突变产生了增强的辛酸生产，但没有产生己酸。由于辛酸是辛酸乙酯的前体，而辛酸乙酯是一种赋予 "果味-花香 "风味的化合物，使用这种突变体可能使新型清酒的生产成为可能。

Key words:C8中链脂肪酸 抗脑膜素菌株 脂肪酸合成酶 风味成分 清酒酵母

酿酒酵母 是酒精饮料行业中的一种关键微生物，它不仅被用作发酵剂，而且也是风味的决定因素。因此，人们不断寻求具有特定或理想特性的酵母菌株，以提高酒精饮料的质量或制造工艺。在风味方面，酵母菌株K-1801（Yoshida 2006）能产生高水平的理想的苹果风味成分己酸乙酯，现在被广泛用于生产清酒，一种日本酒精饮料。K-1801最初是作为一个突变体被分离出来的，该突变体对抗生素cerulenin（一种脂肪酸合成酶的抑制剂）表现出抗性，通过在cerulenin的存在下进行培养（Inokoshi等人，1994）。在该菌株中观察到的己酸乙酯生产水平的提高，可能是由于前体己酸（己酸，C6中链脂肪酸）的合成增加所致。同时，K-1801表现出的神经氨酸抗性和己酸生产水平的提高被发现是脂肪酸合成酶基因FAS2的点突变的结果，导致脂肪酸合成酶α亚基（Fas2蛋白）1250位的氨基酸替换（Gly1250Ser，1250S）（Aritomi等人，2004）。

真菌脂肪酸合成酶是一个由6个α和6个β亚基（a6b6）组成的异型十二边形复合物，分别由基因FAS2和FAS1编码，可以催化脂肪酸合成的所有步骤。因此，FAS2已成为操纵清酒脂肪酸组成和风味的一个重要平台。然而，在抗脑膜素的K-1801突变体中，管理己酸生产的机制仍然不清楚。此外，编码FAS2其他突变的其他抗脑膜素的酵母菌株还没有被分离出来。

在这里，我们描述了清酒酵母菌株Meijo-9的FAS2的一个新的突变，Meijo-9是一种二倍体酵母，最初由Niigata Meijo Co.(Ojiya, Niigata, Japan)，它是通过突变筛选方法产生的，并通过26S rDNA测序确认为S. cerevisiae。简而言之，1×106 CFU/板的亲本酵母菌株在含有1 mg-L-1 cerulenin的SD培养基[2%葡萄糖，0.67% Difco酵母氮基，不含氨基酸（Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA）]上培养7天，30℃。然后分离出72个抗脑膜素的菌落，用于接种10毫升YPD培养基（1%酵母提取物、2%多肽和2%葡萄糖），并在30℃下培养2天。如前所述（Tomotake等人，2006年），初步测量每个菌株的培养上清液中的游离脂肪酸浓度。菌株C8-222表现出丰富的游离脂肪酸的表达，因此被选作进一步的特征分析。

对C8-222的FAS2基因进行测序，发现在FAS2开放阅读框的核苷酸3,758处有一个新的点突变（G转C），导致Fas2蛋白的残基1,253处的Gly转Ala替代（Gly1253Ala，1253A）（图1A）。此外，在这个突变的位置只检测到一个细胞特异性的峰，表明FAS2-1253A突变是同质的。Meijo-9的FAS2的DNA序列已提交给DDBJ核苷酸序列数据库，登录号为LC093835。

为了分析亲本和C8-222突变体菌株产生的游离脂肪酸和脂肪酸酯，将每个菌株在300毫升的曲酒提取物培养基中于25℃下培养5天。简而言之，气相色谱条件如下：仪器，GC-14B（Shimadzu，京都，日本）；检测，火焰电离；色谱柱，InertCap FFAP熔融石英毛细管型（0.25毫米内径×15米；df=0.25毫米；GL Sciences，东京，日本）；柱温，100℃5分钟，以10℃/分钟升至240℃，然后保持20分钟；载气，50千帕的氦气。亲本和C8-222突变体菌株的游离脂肪酸组成见图1B。值得注意的是，虽然每个菌株产生的己酸数量没有差异，但C8-222产生的辛酸（辛酸，C8中链脂肪酸；4.24 mg-L-1）的水平明显高于亲本菌株（0.91 mg-L-1）。同时，如前所述（Ina等人，1990年），测量了从每个菌株收获的培养上清液中的辛酸乙酯浓度。正如预期的那样，C8-222也产生了比亲本菌株（0.92 mg-L-1）更高的辛酸乙酯水平（2.00 mg-L-1）。据我们所知，这是首次对FAS2突变的分析，该突变可选择性地增加辛酸的合成，而辛酸乙酯的前体（Ichikawa等人，1991年）可赋予清酒 "花果味 "的风味（González等人，2007年）。因此，使用C8-222可以生产出具有独特风味的清酒。

然后利用体外定点诱变的方法来确认Gly1253Ala突变对S. cerevisiae的游离脂肪酸组成的影响。简而言之，包含FAS2突变版本（FAS2-1250S；（Akada等，1999）的质粒pRSFAS6是从日本文部科学省的国家生物资源项目（NBRP）获得的。具体来说，FAS2-1250S等位基因的核苷酸序列先前已从野生型的GGT（Gly）序列改变为1250密码子处的AGT（Ser）。因此，使用QuikChange II XL定点诱变试剂盒（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）将pRSFAS6中的Gly1250Ser突变还原为野生型序列，从而产生了质粒pFAS2-1250G-3。然后通过体外定点诱变将新的Gly1253Ala突变引入pFAS2-1250G-3，得到质粒pFAS2-1253A-31。然后使用S. cerevisiaeDirect Transformation Kit（Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan）将这三个质粒送入实验室的S. cerevisiae菌株YPH250（野生型），并对含有每个质粒的转化体进行了进一步表征。

按照以前的描述（Kotaka等人，2010年），对Cerulenin抗性进行了研究，但做了一些修改。简而言之，将菌株在5毫升YPD培养基中于30℃培养2天，然后收获细胞，用灭菌水洗涤，连续稀释10倍，点在含有1毫克-L-1 cerulenin的固体SD培养基上，并在25℃培养4天。值得注意的是，分别表达Fas2 Gly1250Ser和Gly1253Ala变体的NM-C6和NM-C8转化体，而不是野生型（YPH250）菌株或编码野生型FAS2 基因的NM-C转化体，在抗生素存在下都表现出生长（表1）。这些结果证实，Gly1250Ser和Gly1253Ala突变都赋予了Cerulenin抗性。

将菌株YPH250和三个转化体NM-C、NM-C8和NM-C6在300mL曲酒提取物培养基中于15℃培养7天，并按所述方法测定所产生的培养上清液中游离脂肪酸的浓度（de Jong和Badings 1990）。NM-C8比YPH250、NM-C或NM-C6多生产1.6-2.1倍的辛酸（表1），表明Gly1253Ala突变驱动了辛酸的大量生产。

在这项研究中，我们证明了编码FAS2-Gly1253Ala 等位基因的耐cerulenin菌株C8-222表现出升高的辛酸产量。这里的研究结果表明，由Gly1253突变以及Gly1250突变引起的结构变化会影响Fas2蛋白产生的脂肪酸的链长。在以前的研究中，（Akada等人，1999）构建了FAS2 中编码Gly1250Ala（1250A；FAS2-1250A）和Gly1250Cys（1250C； FAS2-1250C）突变的菌株，发现增加第1250个氨基酸的侧链的体积会导致己酸的产生增加。这种产量的增加被认为是由于通过增加侧链的体积对脂肪酸的合成（即Fas2酶的活性）有更大的抑制作用（Aritomi等人，2004）。然而，Fas2酶的活性与Gly1250和Gly1253之间的关系仍然不清楚。因此，需要对Fas2蛋白进行进一步的结构分析，以阐明酵母中C6或C8脂肪酸产量增加的机制。

综上所述，我们分离出了一个抗脑膜素的酵母菌株，它编码了一个新的FAS2突变，可以选择性地刺激辛酸的产生。我们的发现应该有助于进一步改进清酒酵母。

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披露

作者声明没有利益冲突。本研究中进行的所有实验都符合日本的现行法律规定。

鸣谢

我们感谢新泻县清酒研究所的成员的支持和帮助。特别是，我们感谢渡边谦一所长的有益讨论和热情鼓励。我们还感谢日本文部科学省的NBRP提供的S. cerevisiae菌株YPH250和质粒pRSFAS6。

参考文献

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图例

图1.确定了酿酒酵母FAS2基因的一个新的突变。A：野生型清酒酵母菌株Meijo-9和突变体菌株C8-222的FAS2位点的DNA测序。箭头标志着FAS2开放阅读框架3,758号核苷酸的G-C突变，以及相应的1,253号密码子的Gly-Ala氨基酸替换。B：Meijo-9和C8-222的游离脂肪酸概况。