Ютака Нагая,b, Тошиаки Судзукия, Сусуму Ямашитаа, Тошио Йохк, Юджи Тасакид,*.

aРазработка и исследовательская лаборатория, Niigata Meijo Co., Ltd., 1-8-39 Toei, Ojiya, Niigata 947-0004, Япония

bВысшая школа науки и технологии и cКафедра прикладной биологической химии сельскохозяйственного факультета Университета Ниигата, 2-8050 Икараси, Ниси-ку, Ниигата, 950-2181, Япония

dДепартамент инженерии материалов, Национальный технологический институт, колледж Нагаока, 888, Нисикатагаи, Нагаока, Ниигата 940-8532, Япония

*Корреспондирующий автор:

Ю. Тасаки

Тел: +81-258-34-9405

Факс: +81-258-34-9700

E-mail: ytasaki@nagaoka-ct.ac.jp

Текст: 10 страниц; таблицы: 1; рисунки: 1

Аннотация

Здесь мы описываем C8-222, новый штамм Saccharomyces cerevisiae Meijo-9, устойчивый к церуленину, который кодирует точечную мутацию( мутацияFAS2-1253A ), приводящую к замене Gly на Ala в положении 1,253 альфа-субъединицы синтазы жирных кислот (белок Fas2), которая была выделена традиционным скринингом в присутствии церуленина. Примечательно, что эта мутация привела к усиленному производству каприловой кислоты, но не капроевой кислоты. Поскольку каприловая кислота является предшественником этил каприлата, соединения, придающего "фруктово-цветочный" вкус, использование этого мутанта может позволить производить новые виды саке.

Ключевые слова: C8 среднецепочечная жирная кислота, церуленин-резистентный штамм, синтаза жирных кислот, компонент вкуса, дрожжи для саке

Saccharomyces cerevisiae - ключевой микроорганизм в индустрии алкогольных напитков, который используется не только как агент брожения, но и как определитель вкуса. Поэтому постоянно ведется поиск дрожжевых штаммов со специфическими или желательными характеристиками для улучшения качества или производственных процессов алкогольных напитков. Что касается вкуса, то дрожжевой штамм K-1801 (Yoshida 2006), который производит высокие уровни желательного компонента яблочного вкуса - этил капроата, в настоящее время широко используется для производства саке, японского алкогольного напитка. Первоначально K-1801 был выделен как мутант, проявляющий устойчивость к антибиотику церуленину, ингибитору синтазы жирных кислот, путем культивирования в присутствии церуленина (Inokoshi et al. 1994). Повышенный уровень продукции этил-капроата, наблюдаемый у этого штамма, вероятно, связан с повышенным синтезом предшественника капроевой кислоты (гексаноевой кислоты, среднецепочечной жирной кислоты C6). Между тем, было установлено, что устойчивость к церуленину и повышенный уровень продукции капроевой кислоты, наблюдаемые у K-1801, являются результатом точечной мутации в гене синтазы жирных кислот FAS2, приводящей к замене аминокислоты (Gly1250Ser, 1250S) в положении 1250 альфа-субъединицы синтазы жирных кислот (белок Fas2) (Aritomi et al. 2004).

Синтаза жирных кислот грибов представляет собой гетерододекамерный комплекс, состоящий из шести α и шести β субъединиц (a6b6), которые кодируются генами FAS2 и FAS1, соответственно, и катализирующий все этапы синтеза жирных кислот. Соответственно, FAS2 стал важной платформой для манипулирования жирнокислотным составом и вкусом саке. Однако механизм, определяющий повышенное производство капроевой кислоты в мутанте K-1801, устойчивом к церуленину, остается неясным. Кроме того, еще предстоит выделить другие штаммы дрожжей, устойчивые к церуленину и кодирующие другие мутации в FAS2.

Здесь мы описываем новую мутацию в FAS2 в штамме саке дрожжей Meijo-9, диплоидных дрожжей, первоначально выделенных компанией Niigata Meijo Co., Ltd. (Ojiya, Niigata, Japan). (Ojiya, Niigata, Japan), который был получен методом мутационного скрининга и подтвержден как S. cerevisiae с помощью секвенирования 26S рДНК. Вкратце, 1 × 106 КОЕ/планшет родительского штамма дрожжей культивировали на среде SD [2% глюкозы, 0,67% дрожжевой азотной основы Difco без аминокислот (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA) ], содержащей 1 мг-L-1 церуленина, в течение 7 дней при 30 °C. Затем были выделены 72 колонии, устойчивые к церуленину, которые были использованы для инокуляции 10 мл среды YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% полипептона и 2% глюкозы) и культивировались при 30 °C в течение 2 д. Концентрация свободных жирных кислот в супернатанте культуры каждого штамма была предварительно измерена, как описано ранее (Tomotake et al. 2006). Штамм C8-222 демонстрировал обильную экспрессию свободных жирных кислот и поэтому был выбран для дальнейшей характеристики.

Секвенирование гена FAS2 из C8-222 выявило новую точечную мутацию (G - C) на нуклеотиде 3 758 открытой рамки считывания FAS2, которая привела к замене Gly на Ala в остатке 1 253 (Gly1253Ala, 1253A) белка Fas2 (рис. 1A). Более того, в позиции этой мутации был обнаружен только цитозин-специфический пик, что указывает на то, что мутация FAS2-1253A была гомозиготной. Последовательность ДНК FAS2 из Meijo-9 была представлена в базу данных нуклеотидных последовательностей DDBJ под номером доступа LC093835.

Для анализа свободных жирных кислот и эфиров жирных кислот, продуцируемых родительским и мутантным штаммами C8-222, каждый штамм культивировали в 300 мл среды с экстрактом коджи при 25 °C в течение 5 дней. Концентрацию свободных жирных кислот в супернатанте культуры измеряли методом газовой хроматографии (ГХ), как описано ранее (de Jong and Badings 1990). Вкратце, условия ГХ были следующими: прибор - GC-14B (Shimadzu, Киото, Япония); обнаружение - пламенная ионизация; колонка - InertCap FFAP с плавленым кварцем капиллярного типа (0,25 мм I.D. × 15 м; df = 0,25 мм; GL Sciences, Токио, Япония); температура колонки - 100 °C в течение 5 мин, увеличивалась до 240 °C со скоростью 10 °C/мин, а затем выдерживалась в течение 20 мин; газ-носитель - гелий при 50 кПа. Состав свободных жирных кислот родительского и мутантного штаммов C8-222 показан на рис. 1B. Примечательно, что если в количестве капроевой кислоты, продуцируемой каждым штаммом, разницы не было, то C8-222 продуцировал заметно более высокий уровень каприловой кислоты (октановой кислоты, среднецепочечной жирной кислоты C8; 4,24 мг-Л-1), чем родительский штамм (0,91 мг-Л-1). Между тем, концентрация этил каприлата в супернатанте культуры, собранной из каждого штамма, измерялась, как описано ранее (Ina et al. 1990). Как и ожидалось, C8-222 также продуцировал более высокие уровни этил-каприлата (2,00 мг-Л-1), чем родительский штамм (0,92 мг-Л-1). Насколько нам известно, это первый анализ мутации FAS2, которая избирательно увеличивает синтез каприловой кислоты, предшественника этил каприлата (Ichikawa et al. 1991), придающего саке "фруктово-цветочный" аромат (González et al. 2007). Таким образом, использование C8-222 может позволить производить саке с выраженным вкусовым профилем.

Затем для подтверждения влияния мутации Gly1253Ala на состав свободных жирных кислот S. cerevisiae был использован метод сайт-направленного мутагенеза in vitro. Вкратце, плазмида pRSFAS6, содержащая мутировавшую версию FAS2(FAS2-1250S; (Akada et al. 1999)), была получена из Национального проекта биоресурсов (NBRP) Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии (MEXT) Японии. В частности, нуклеотидная последовательность аллеля FAS2-1250S была ранее изменена с последовательности GGT (Gly) дикого типа на AGT (Ser) в кодоне 1,250. Поэтому мутация Gly1250Ser в pRSFAS6 была возвращена к последовательности дикого типа с помощью набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II XL (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), в результате чего была получена плазмида pFAS2-1250G-3. Затем новая мутация Gly1253Ala была введена в pFAS2-1250G-3 с помощью сайт-направленного мутагенеза in vitro, в результате чего была получена плазмида pFAS2-1253A-31. Затем эти три плазмиды были доставлены в лабораторный штамм S. cerevisiae YPH250 (дикого типа) с помощью набора для прямой трансформации S. cerevisiae (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Осака, Япония), и трансформанты, содержащие каждую плазмиду, были далее охарактеризованы.

Устойчивость к церуленину исследовали, как описано ранее (Kotaka et al. 2010), но с некоторыми изменениями. Вкратце, штаммы культивировали в 5 мл среды YPD при 30 °C в течение 2 д. Затем клетки собирали, промывали стерилизованной водой, серийно разводили в 10 раз, переносили на твердую среду SD, содержащую 1 мг-л-1 церуленина, и инкубировали при 25 °C в течение 4 д. Примечательно, что трансформанты NM-C6 и NM-C8, экспрессирующие варианты Fas2 Gly1250Ser и Gly1253Ala, соответственно, но не штамм дикого типа (YPH250) или трансформант NM-C, кодирующий ген FAS2 дикого типа, демонстрировали рост в присутствии антибиотика (Таблица 1). Эти результаты подтверждают, что мутации Gly1250Ser и Gly1253Ala обусловливают устойчивость к церуленину.

Штамм YPH250 и три трансформанта, NM-C, NM-C8 и NM-C6, культивировали в 300 мл среды с экстрактом коджи при 15 °C в течение 7 дней, а концентрацию свободных жирных кислот в полученных культуральных супернатантах измеряли, как описано (de Jong and Badings 1990). NM-C8 продуцировал в 1,6-2,1 раза больше каприловой кислоты, чем YPH250, NM-C или NM-C6 (Таблица 1), что свидетельствует о том, что мутация Gly1253Ala способствует обильному производству каприловой кислоты.

В данном исследовании мы продемонстрировали, что устойчивый к церуленину штамм C8-222, кодирующий аллель FAS2-Gly1253Ala , демонстрирует повышенную продукцию каприловой кислоты. Представленные здесь результаты показывают, что структурные изменения, вызванные мутацией Gly1253, так же как и мутацией Gly1250, влияют на длину цепи жирных кислот, продуцируемых белком Fas2. В предыдущем исследовании (Akada et al. 1999) сконструировали штаммы, кодирующие мутации Gly1250Ala (1250A; FAS2-1250A) и Gly1250Cys (1250C; FAS2-1250C) в FAS2 , и обнаружили, что увеличение объема боковой цепи 1250-й аминокислоты приводит к увеличению продукции капроевой кислоты. Предполагается, что это увеличение продукции связано с большим ингибированием синтеза жирных кислот (т.е. активности фермента Fas2) за счет увеличения объема боковой цепи (Aritomi et al. 2004). Однако связь между активностью фермента Fas2 и Gly1250 и Gly1253 остается неясной. Поэтому для выяснения механизма, регулирующего повышенное производство C6 или C8 жирных кислот в дрожжах, необходим дальнейший структурный анализ белка Fas2.

Таким образом, мы выделили устойчивый к церуленину штамм дрожжей, кодирующий новую мутацию FAS2, которая избирательно стимулирует производство каприловой кислоты. Наши результаты должны способствовать дальнейшему улучшению дрожжей для саке.

advertisement

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Все эксперименты, проведенные в данном исследовании, соответствуют действующему законодательству Японии.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников Научно-исследовательского института сакэ префектуры Ниигата за поддержку и помощь. В частности, мы благодарны директору Кен-ичи Ватанабе за полезные обсуждения и теплые слова поддержки. Мы также благодарим NBRP при MEXT, Япония, за предоставление штамма S. cerevisiae YPH250 и плазмиды pRSFAS6.

ССЫЛКИ

Akada R, Matsuo K, Aritomi K, Nishizawa Y, 1999. Создание рекомбинантных дрожжей саке, содержащих доминантную мутацию FAS2 без посторонних последовательностей, с помощью двухэтапного протокола замены генов. Journal of Bioscience and Bioengineering 87: 43-48; http://dx.doi.org/10.1016/S1389-1723(99)80006-1.

Aritomi K, Hirosawa I, Hoshida H, Shiigi M, Nishizawa Y, Kashiwagi S, Akada R, 2004. Самоклонирующиеся штаммы дрожжей, содержащие новые мутации FAS2, производят большее количество этил капроата в японском саке. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 68: 206-214; http://dx.doi.org/10.1271/bbb.68.206.

de Jong C, Badings HT, 1990. Determination of free fatty acids in milk and cheese procedures for extraction, clean up, and capillary gas chromatographic analysis. Journal of High Resolution Chromatography 13: 94-98; http://dx.doi.org/10.1002/jhrc.1240130204.

Гонсалес СС, Галло Л, Климент МД, Баррио Е, Кверол А, 2007. Энологическая характеристика природных гибридов Saccharomyces cerevisiae и S. kudriavzevii. Международный журнал пищевой микробиологии 116: 11-18; http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2006.10.047.

Ichikawa E, Hosokawa N, Hata Y, Abe Y, Suginami K, Imayasu S, 1991. Выведение дрожжей для саке с улучшенной продуктивностью этил капроата. Сельскохозяйственная и биологическая химия 55: 2153-2154; http://dx.doi.org/10.1080/00021369.1991.10870932.

Ina K, Takasawa R, Yagi A, Ina H, Kishima I, 1990. Изотиоцианаты в стеблях и листьях васаби(Wasabia japonica Matsum). Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi 37: 256-260; http://dx.doi.org/10.3136/nskkk1962.37.4_256.

Inokoshi J, Tomoda H, Hashimoto H, Watanabe A, Takeshima H, Ōmura S, 1994. Устойчивые к церуленину мутанты Saccharomyces cerevisiae с измененным геном синтазы жирных кислот. Молекулярная и общая генетика 244: 90-96; http://dx.doi.org/10.1007/bf00280191.

Kotaka A, Sahara H, Hata Y, 2010. Конструирование и применение диплоидных дрожжей саке с гомозиготной мутацией в гене FAS2. Journal of Bioscience and Bioengineering 110: 675-678; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiosc.2010.07.007.

Tomotake H, Okuyama R, Katagiri M, Fuzita M, Yamato M, Ota F, 2006. Сравнение молока голштинской коровы и японо-сааненской козы по составу жирных кислот, переваримости липидов и белковому профилю. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 70: 2771-2774; http://dx.doi.org/10.1271/bbb.60267.

Йошида К, 2006. Дрожжи длясакэ Kyoukai 1801. Journal of the Brewing Society of Japan 101: 910-922; http://dx.doi.org/10.6013/jbrewsocjapan1988.101.910.

Легенды рисунка

Рис. 1. Идентификация новой мутации в гене FAS2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. A: Секвенирование ДНК локусов FAS2 дикого типа дрожжей саке штамма Meijo-9 и мутантного штамма C8-222. Стрелками отмечена мутация G - C на нуклеотиде 3 758 открытой рамки считывания FAS2 и соответствующая замена аминокислоты Gly на Ala в кодоне 1 253. B: Профили свободных жирных кислот Meijo-9 и C8-222.