Yutaka Nagaia,b,Toshiaki Suzukia, Susumu Yamashitaa, Toshio Johc, Yuji Tasakid,*

aLaboratorium Pengembangan dan Penelitian, Niigata Meijo Co, Ltd, 1-8-39 Toei, Ojiya, Niigata 947-0004, Jepang

bSekolah Pascasarjana Sains dan Teknologi, dan cDepartemen Kimia Biologi Terapan, Fakultas Pertanian, Universitas Niigata, 2-8050 Ikarashi, Nishi-ku, Niigata, Niigata 950-2181, Jepang

dDepartemen Teknik Material, Institut Teknologi Nasional, Nagaoka College, 888, Nishikatagai, Nagaoka, Niigata 940-8532, Jepang

*Penulis yang berkorespondensi:

Y. Tasaki

Tel: +81-258-34-9405

Faksimili: +81-258-34-9700

E-mail: ytasaki@nagaoka-ct.ac.jp

Teks: 10 halaman; tabel: 1; gambar: 1

Abstrak

Di sini, kami menjelaskan C8-222, strain baru yang tahan cerulenin dari Saccharomyces cerevisiae Meijo-9 yang mengkodekan mutasi titik(mutasi FAS2-1253A ) yang menghasilkan substitusi Gly ke Ala pada posisi 1.253 dari subunit alfa sintase asam lemak (protein Fas2), yang diisolasi dengan penyaringan tradisional dengan adanya cerulenin. Secara khusus, mutasi ini menghasilkan peningkatan produksi asam kaprilat, tetapi tidak untuk asam kaproat. Karena asam kaprilat adalah prekursor etil kaprilat, senyawa yang memberikan rasa "buah-bunga", penggunaan mutan ini dapat memungkinkan produksi sake jenis baru.

Kata kunci: Asam lemak rantai menengah C8, Strain tahan Cerulenin, Sintase asam lemak, Komponen rasa, Ragi sake

Saccharomyces cerevisiae adalah mikroorganisme utama dalam industri minuman beralkohol yang digunakan, tidak hanya sebagai agen fermentasi, tetapi juga sebagai penentu rasa. Oleh karena itu, strain ragi dengan karakteristik spesifik atau yang diinginkan terus dicari untuk meningkatkan kualitas atau proses pembuatan minuman beralkohol. Dalam hal rasa, strain ragi K-1801 (Yoshida 2006), yang menghasilkan komponen rasa etil kaproat seperti apel yang diinginkan, sekarang banyak digunakan untuk memproduksi sake, minuman beralkohol Jepang. K-1801 pada awalnya diisolasi sebagai mutan yang menunjukkan resistensi terhadap antibiotik cerulenin, suatu penghambat sintase asam lemak, melalui kultivasi dengan adanya cerulenin (Inokoshi et al. 1994). Peningkatan tingkat produksi etil kaproat yang diamati pada strain ini kemungkinan besar disebabkan oleh peningkatan sintesis prekursor asam kaproat (asam heksanoat, asam lemak rantai menengah C6). Sementara itu, resistensi cerulenin dan peningkatan kadar produksi asam kaproat yang ditunjukkan oleh K-1801 ditemukan sebagai hasil dari mutasi titik pada gen sintase asam lemak FAS2, yang menghasilkan substitusi asam amino (Gly1250Ser, 1250S) pada posisi 1.250 subunit alfa sintase asam lemak (protein Fas2) (Aritomi et al. 2004).

Fungal fatty acid synthase adalah kompleks heterododekamer yang terdiri dari enam subunit α dan enam subunit β (a6b6), yang dikodekan oleh gen FAS2 dan FAS1, yang mengkatalisis semua langkah sintesis asam lemak. Oleh karena itu, FAS2 telah menjadi platform penting untuk memanipulasi komposisi asam lemak dan rasa sake. Namun, mekanisme yang mengatur peningkatan produksi asam kaproat pada mutan K-1801 yang resisten terhadap cerulenin masih belum jelas. Selain itu, strain ragi resisten cerulenin tambahan yang mengkode mutasi lain dalam FAS2 belum diisolasi.

Di sini, kami menjelaskan mutasi baru pada FAS2 dari strain ragi sake Meijo-9, ragi diploid yang awalnya diisolasi oleh Niigata Meijo Co, Ltd. (Ojiya, Niigata, Jepang), yang dihasilkan melalui pendekatan skrining mutasi dan dikonfirmasi sebagai S. cerevisiae melalui sekuensing 26S rDNA. Secara singkat, 1 × 106 CFU / plate dari strain ragi induk dibudidayakan pada media SD [2% glukosa, 0,67% basa nitrogen ragi Difco tanpa asam amino (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)] yang mengandung 1 mg-L-1 cerulenin selama 7 hari pada suhu 30 ° C. Sebanyak 72 koloni resisten cerulenin kemudian diisolasi, digunakan untuk menginokulasi 10 mL medium YPD (ekstrak ragi 1%, polipepton 2%, dan glukosa 2%), dan dikultivasi pada suhu 30°C selama 2 hari. Konsentrasi asam lemak bebas pada supernatan kultur masing-masing strain diukur sebelumnya, seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (Tomotake et al. 2006). Strain C8-222 menunjukkan ekspresi asam lemak bebas yang melimpah dan oleh karena itu dipilih untuk karakterisasi lebih lanjut.

Pengurutan gen FAS2 dari C8-222 mengungkapkan mutasi titik baru (G ke C) pada nukleotida 3.758 dari kerangka bacaan terbuka FAS2 yang menghasilkan substitusi Gly ke Ala pada residu 1.253 (Gly1253Ala, 1253A) protein Fas2 (Gbr. 1A). Selain itu, hanya puncak spesifik sitosin yang terdeteksi pada posisi mutasi ini, yang menunjukkan bahwa mutasi FAS2-1253A adalah homozigot. Sekuen DNA FAS2 dari Meijo-9 telah dikirimkan ke database sekuen nukleotida DDBJ dengan nomor aksesi LC093835.

Untuk menganalisis asam lemak bebas dan ester asam lemak yang dihasilkan oleh galur induk dan mutan C8-222, masing-masing galur dibudidayakan dalam 300 mL media ekstrak koji pada suhu 25°C selama 5 hari. Konsentrasi asam lemak bebas dalam supernatan kultur diukur dengan menggunakan kromatografi gas (GC), seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (de Jong dan Badings 1990). Secara singkat, kondisi GC adalah sebagai berikut: instrumen, GC-14B (Shimadzu, Kyoto, Jepang); deteksi, ionisasi nyala; kolom, InertCap FFAP tipe kapiler silika leburan (0,25 mm ID × 15 m; df = 0,25 mm; GL Sciences, Tokyo, Jepang); temperatur kolom, 100°C selama 5 menit, meningkat menjadi 240°C pada 10°C/menit, dan kemudian ditahan selama 20 menit; gas pembawa, helium pada 50 kPa. Komposisi asam lemak bebas dari galur mutan induk dan mutan C8-222 ditunjukkan pada Gbr. 1B. Khususnya, meskipun tidak ada perbedaan dalam jumlah asam kaproat yang dihasilkan oleh masing-masing strain, C8-222 menghasilkan tingkat asam kaprilat yang jauh lebih tinggi (asam oktanoat, asam lemak rantai menengah C8; 4,24 mg-L-1) daripada strain induknya (0,91 mg-L-1). Sementara itu, konsentrasi etil kaprilat dalam supernatan kultur yang dipanen dari setiap strain diukur seperti yang dijelaskan sebelumnya (Ina et al. 1990). Seperti yang diharapkan, C8-222 juga menghasilkan kadar etil kaprilat yang lebih tinggi (2,00 mg-L-1) dibandingkan dengan galur induknya (0,92 mg-L-1). Sejauh pengetahuan kami, ini adalah analisis pertama dari mutasi FAS2 yang secara selektif meningkatkan sintesis asam kaprilat, prekursor etil kaprilat (Ichikawa et al. 1991) yang memberikan rasa "buah-bungaan" pada sake (González et al. 2007). Dengan demikian, penggunaan C8-222 memungkinkan produksi sake dengan profil rasa yang berbeda.

Pendekatan mutagenesis yang diarahkan pada lokasi in vitro kemudian digunakan untuk mengkonfirmasi efek mutasi Gly1253Ala pada komposisi asam lemak bebas S. cerevisiae. Secara singkat, plasmid pRSFAS6, yang mengandung versi mutasi FAS2(FAS2-1250S; (Akada et al. 1999), diperoleh dari National Bio-Resource Project (NBRP) dari Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Olahraga, Sains & Teknologi (MEXT) Jepang. Secara khusus, urutan nukleotida alel FAS2-1250S sebelumnya diubah dari urutan GGT (Gly) tipe liar menjadi AGT (Ser) pada kodon 1.250. Oleh karena itu, mutasi Gly1250Ser pada pRSFAS6 dikembalikan ke urutan tipe liar menggunakan QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), sehingga menghasilkan plasmid pFAS2-1250G-3. Mutasi Gly1253Ala yang baru kemudian dimasukkan ke dalam pFAS2-1250G-3 melalui in vitro site-directed mutagenesis, menghasilkan plasmid pFAS2-1253A-31. Ketiga plasmid ini kemudian diantarkan ke dalam laboratorium S. cerevisiae strain YPH250 (tipe liar) menggunakan Kit Transformasi Langsung S. cerevisiae (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Jepang), dan transforman yang mengandung masing-masing plasmid dikarakterisasi lebih lanjut.

Resistensi cerulenin diselidiki seperti yang dijelaskan sebelumnya (Kotaka et al. 2010), tetapi dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, galur dibudidayakan dalam 5 mL media YPD pada suhu 30°C selama 2 d. Sel kemudian dipanen, dicuci dengan air steril, diencerkan 10 kali lipat secara serial, diteteskan pada media SD padat yang mengandung 1 mg-L-1 cerulenin, dan diinkubasi pada suhu 25°C selama 4 hari. Khususnya, baik transforman NM-C6 dan NM-C8, yang masing-masing mengekspresikan varian Fas2 Gly1250Ser dan Gly1253Ala, tetapi tidak pada galur tipe liar (YPH250) atau transforman NM-C, yang mengkodekan gen FAS2 tipe liar, menunjukkan pertumbuhan dengan adanya antibiotik (Tabel 1). Hasil ini mengkonfirmasi bahwa mutasi Gly1250Ser dan Gly1253Ala memberikan resistensi cerulenin.

Strain YPH250 dan tiga transforman, NM-C, NM-C8, dan NM-C6, dibudidayakan dalam 300 mL media ekstrak koji pada suhu 15°C selama 7 hari, dan konsentrasi asam lemak bebas dalam supernatan kultur yang dihasilkan diukur seperti yang telah dijelaskan (de Jong dan Badings 1990). NM-C8 menghasilkan asam kaprilat 1,6-2,1 kali lipat lebih banyak dibandingkan dengan YPH250, NM-C, atau NM-C6 (Tabel 1), yang menunjukkan bahwa mutasi Gly1253Ala mendorong produksi asam kaprilat yang melimpah.

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa galur resisten cerulenin C8-222, yang mengkode alel FAS2-Gly1253Ala , menunjukkan peningkatan produksi asam kaprilat. Temuan yang disajikan di sini menunjukkan bahwa perubahan struktural yang disebabkan oleh mutasi Gly1253, serta mutasi Gly1250, memengaruhi panjang rantai asam lemak yang diproduksi oleh protein Fas2. Dalam penelitian sebelumnya, (Akada et al. 1999) membuat galur-galur yang mengkode mutasi Gly1250Ala (1250A; FAS2-1250A) dan Gly1250Cys (1250C; FAS2-1250C) pada FAS2 dan menemukan bahwa peningkatan sebagian besar rantai samping asam amino ke-1.250 menghasilkan peningkatan produksi asam kaproat. Peningkatan produksi ini diasumsikan karena penghambatan yang lebih besar dari sintesis asam lemak (yaitu, aktivitas enzim Fas2) melalui peningkatan jumlah rantai samping (Aritomi et al. 2004). Namun, hubungan antara aktivitas enzim Fas2 dan Gly1250 dan Gly1253 masih belum jelas. Oleh karena itu, analisis struktural lebih lanjut dari protein Fas2 diperlukan untuk menjelaskan mekanisme yang mengatur peningkatan produksi asam lemak C6 atau C8 pada ragi.

Singkatnya, kami telah mengisolasi strain ragi tahan cerulenin yang mengkode mutasi FAS2 baru yang secara selektif merangsang produksi asam kaprilat, sehingga temuan kami dapat memfasilitasi peningkatan lebih lanjut dari ragi sake.

advertisement

Pengungkapan

Para penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan. Semua eksperimen yang dilakukan dalam penelitian ini mematuhi hukum yang berlaku di Jepang.

Ucapan terima kasih

Kami berterima kasih kepada anggota Institut Penelitian Sake Prefektur Niigata atas dukungan dan bantuan mereka. Secara khusus, kami berterima kasih kepada Direktur Ken-ichi Watanabe atas diskusi yang bermanfaat dan dorongan yang hangat. Kami juga berterima kasih kepada NBRP dari MEXT, Jepang, yang telah menyediakan S. cerevisiae strain YPH250 dan plasmid pRSFAS6.

REFERENSI

Akada R, Matsuo K, Aritomi K, Nishizawa Y, 1999. Konstruksi ragi sake rekombinan yang mengandung mutasi FAS2 dominan tanpa sekuen asing dengan protokol penggantian gen dua langkah. Journal of Bioscience and Bioengineering 87: 43-48; http://dx.doi.org/10.1016/S1389-1723(99)80006-1.

Aritomi K, Hirosawa I, Hoshida H, Shiigi M, Nishizawa Y, Kashiwagi S, Akada R, 2004. Strain ragi kloning mandiri yang mengandung mutasi FAS2 baru menghasilkan jumlah etil kaproat yang lebih tinggi dalam sake Jepang. Biosains, Bioteknologi, dan Biokimia 68: 206-214; http://dx.doi.org/10.1271/bbb.68.206.

de Jong C, Badings HT, 1990. Penentuan asam lemak bebas dalam susu dan keju dengan prosedur ekstraksi, pembersihan, dan analisis kromatografi gas kapiler. Jurnal Kromatografi Resolusi Tinggi 13: 94-98; http://dx.doi.org/10.1002/jhrc.1240130204.

González SS, Gallo L, Climent MD, Barrio E, Querol A, 2007. Karakterisasi enologi hibrida alami dari Saccharomyces cerevisiae dan S. kudriavzevii. International Journal of Food Microbiology 116: 11-18; http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2006.10.047.

Ichikawa E, Hosokawa N, Hata Y, Abe Y, Suginami K, Imayasu S, 1991. Pengembangbiakan ragi sake dengan peningkatan produktivitas etil kaproat. Agricultural and Biological Chemistry 55: 2153-2154; http://dx.doi.org/10.1080/00021369.1991.10870932.

Ina K, Takasawa R, Yagi A, Ina H, Kishima I, 1990. Isothiocyanates pada batang dan daun wasabi(Wasabia japonica Matsum). Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi 37: 256-260; http://dx.doi.org/10.3136/nskkk1962.37.4_256.

Inokoshi J, Tomoda H, Hashimoto H, Watanabe A, Takeshima H, Ōmura S, 1994. Mutan Saccharomyces cerevisiae yang resisten terhadap cerulenin dengan gen sintase asam lemak yang diubah. Genetika Molekuler dan Umum 244: 90-96; http://dx.doi.org/10.1007/bf00280191.

Kotaka A, Sahara H, Hata Y, 2010. Konstruksi dan aplikasi ragi sake diploid dengan mutasi homozigot pada gen FAS2. Jurnal Biosains dan Bioteknologi 110: 675-678; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiosc.2010.07.007.

Tomotake H, Okuyama R, Katagiri M, Fuzita M, Yamato M, Ota F, 2006. Perbandingan antara susu sapi Holstein dan susu kambing Jepang-Saanen dalam komposisi asam lemak, kecernaan lipid dan profil protein. Biosains, Bioteknologi, dan Biokimia 70: 2771-2774; http://dx.doi.org/10.1271/bbb.60267.

Yoshida K, 2006. Ragisake Kyoukai 1801. Journal of the Brewing Society of Japan 101: 910-922; http://dx.doi.org/10.6013/jbrewsocjapan1988.101.910.

Legenda gambar

Gambar 1. Identifikasi mutasi baru pada gen FAS2 Saccharomyces cerevisiae. A: Pengurutan DNA dari lokus FAS2 dari ragi sake tipe liar strain Meijo-9 dan strain mutan C8-222. Panah menandai mutasi G ke C pada nukleotida 3.758 dari kerangka pembacaan terbuka FAS2, dan substitusi asam amino Gly ke Ala yang sesuai pada kodon 1.253. B: Profil asam lemak bebas Meijo-9 dan C8-222.